1983年,trounson报道使用冷冻保存和融解的人类胚胎移植首例妊娠成功。此后冷冻保存胚胎用于辅助生育技术得以推广。1987年之前3577个胚胎用各种方法冷冻保存融解、移植,大约50%(1794个)融解后有存活力,其中1119个进行了胚胎移植。结果163例获得妊娠(13、4%),其中自然流产占26%,宫外孕4%,此外2例宫内及临产时诊断胎儿畸形。
首例活产的人类胚胎是用了不同于目前广泛使用的冷冻保存法。此例胚胎系用1、5mol/l的dmso冷冻保存。在室温中将冷冻保存液浓度每隔10min逐步增加。在培养液(pbs)中,dmso的初始浓度为0.25mol/l,以后则逐步增加到0.5、1、0和1、5mol/l浓度。dmso浓度达到1、5mol/l后,培养剂中的胚胎以2℃/min的速率从室温冷却到-6℃,然后进行人工种植并在-6℃保持30min。试管再以0.3℃/min速率冷却到-80℃,然后放入液氮内(-196℃)贮存。在融解时试管中胚胎从液氮中转移到-80℃控制箱,再以8℃/min速率融解到+4℃。将dmso逆向稀释。应用上述方法冻融处于4-细胞或8-细胞发育阶段的胚胎,则68/136胚胎存活,其半数或多一些卵裂球保持完好。68个胚胎移植到45个患者中后结果导致9例临床妊娠。
一、用dmso冷冻保存胚胎的方法
(1)胚胎放入冷冻玻璃瓶或管子内。
(2)胚胎从+23℃开始,以2℃/min的速率冷却到-6℃。
(3)种植并在-6℃保持10min。
(4)胚胎以0.1℃/min速率冷却到-80℃。
(5)投入液氮内。
(6)在室温(+23℃)下加入dmso,每隔10min增加浓度0.25mol/l,直到1、5mol/l。
用dmso冷冻保存卵裂胚胎而获临床妊娠的报道发表不久,cohen等报道应用冷冻/融解人类囊胚获得活产婴儿。该报道称体外受精获得的胚胎,受精后在人工环境内可放置4~7d。如囊胚继续发育,则将胚胎放进earl液中,在室温下加入甘油,经过6个不同的步骤,使甘油最后的浓度达到8%~10%。然后将胚胎放进试管内,从室温开始以1℃/min速率降到-7℃,进行手工种植。此后以0.3℃/min速率将试管冷却到-36℃,然后投入液氮中。
二、囊胚冷冻保存步骤
(1)囊胚从23℃起以2℃/分速率冷却到-7℃。
(2)种植并保持10min。
(3)以0.3℃/min速率冷却到-30℃。
(4)投入液氮内。
胚胎融解时,则经历速融过程,即把试管从液氮中移入30℃水浴。然后经逐步稀释除去甘油冷冻液,即培养基中甘油浓度逐步稀释从8%(10min),6%(12min),5%(14min),4%(16min),3%(18min),2%(20min)到1%(20min)。然后在新鲜培养基中冲洗和移植胚胎。在这第一组应用人囊胚进行的实验中,11个患者接受胚胎移植后结果2例妊娠。testart等报道用丙二醇(proh)冷冻保存和贮存体外培养第1~2天的胚胎是一个有效方法。用proh冷冻液能保存发育到原核期、2-细胞期或4-细胞期的胚胎。
三、用proh冷冻保存胚胎的方法
(1)在室温下加入0.5mol/lproh,每隔10min递增0.5mol/l,直到1、5mol/l。
(2)胚胎放入管中,在hepes-htf培养液内加入蔗糖,浓度为0.2mol/l。
(3)胚胎以2℃/min速率冷却到-7℃。
(4)在-7℃下种植及维持10min。
(5)胚胎以0.3℃/min速率冷却到-30℃。
(6)投入液氮内。
最近cohen等还报道47个胚胎移植周期应用proh冷冻液,结果12个妊娠,并认为适时融解和移植胚胎是提高临床效果的重要因素。有关资料证实胚胎融解要与自然周期同步。换言之,移植周期中lh峰提示开始排卵。在自然周期排卵后3h内应同步融解胚胎。如果这种同步融解步骤超过了3h妊娠均未成功。如果采卵周期中于排卵前12h内采卵,而移植的胚胎也在排卵前12h内融解,则妊娠率最高。在有的单位proh最常用于早期胚胎冷冻,少数允许继续生长成囊胚的胚胎则用甘油作为冷冻液。用这种胚胎选择冷冻法,若胚胎在2-细胞期或4-细胞期未能确定其是否正常,可允许发育到囊胚形成,如它们能达到这个发育期,胚胎就可进行冷冻保存。目前认为如果胚胎显示正常发育,则胚胎应尽早冷冻保存。胚胎在体外培养的环境内时间越短,临床效果越佳。但是在某些情况下,若胚胎发育不规则,在冷冻前可让其发育到囊胚期,以证实冷冻胚胎是存活的。trounson与siobiom最近报道了超速冷冻人类胚胎的可行性。用于放置胚胎的dolbecco磷酸盐缓冲液,含有3mol/l的dmso与0.25mol/l的蔗糖,并放在冷冻管内,管子是密封的,将胚胎于室温下置于含上述dmso溶液的管子中持续3min,然后直接投入-196℃液氮中。胚胎融解时则直接从液氮移到37℃水浴。超速冷冻的22例胚胎中18例完好存活。
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